Key words：Inula japonica Thunb.； Tannin； Casein； Complexometric titration
旋覆花为菊科植物旋覆花Inula japonica Thunb.或欧亚旋覆花Inula britannica L.的干燥头状花序，具有降气、消痰、行水、止呕等功效。中医临床多用于风寒咳嗽、痰饮蓄结、胸膈痞满、喘咳痰多、呕吐噫气、心下痞硬等症状［1］。旋覆花中主要有倍半萜内酯、三萜、甾体、黄酮和挥发油等成分［2～4］， 目前 尚无旋覆花中鞣质方面的报道。本实验室 研究 发现旋覆花（Inula japonica Thunb）水提物具有明显降血糖和降血脂作用［5］，检识反应表明水提物中主要含有黄酮、蒽醌、糖类和鞣质等成分。其中用三氯化铁反应鉴定旋覆花中鞣质，反应呈暗绿色，表明含有邻二酚羟基黄酮和儿茶素类缩合鞣质。本实验拟采用干酪素法和络合滴定法测定其中鞣质的含量。
鞣质含量测定方法有多种，其中最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合滴定法、比色法和分光光度法。本实验选择干酪素法是基于干酪素能选择性结合有生理活性的鞣质，从而测定生理活性鞣质的含量，而无活性的鞣酐等鞣质不被测定［6］。络合滴定法是利用鞣质分子中多个邻位酚羟基可作为多基配体与一个中心离子络合，形成环状螯合物，在不同pH值下发生沉淀反应，通过用EDTA反滴定过量金属离子来确定总鞣质的含量。该法准确度和精确度高［7］。 因此拟采用该两种方法对旋覆花中鞣质进行定量分析。
1 器材
1.1 药材
旋覆花（Inula japonica Thub.）购于北京同仁堂药材公司，产地河北省。
1.2 试剂鞣酸（AR，北京化学试剂公司），干酪素（Sigma公司），基准氧化锌（北京益利精细化学有限公司）。铬黑T（北京市旭东化工厂 ），EDTA-2Na（ 北京欣经科生物技术有限公司），Folin试剂（钨酸钠 50 g，加入85％磷酸40 ml和蒸馏水375 ml，混合，加热回流3 h，冷后加水稀释至500 ml，避光保存。），0.1 mol/L醋酸－醋酸钠缓冲液（pH =5.0），其他试剂均为分析纯。
1.3 仪器紫外可见分光光度计（上海尤尼柯公司，型号2802PC）， 电子 天平（十万分之一，赛多利斯，BP211D ） 。
2 方法
2.1 旋覆花水提物的制备旋覆花花序1 kg，加入95%乙醇8 L室温浸泡48 h。过滤，残渣再重复操作1次。醇提后的残渣挥干乙醇后，用10 L蒸馏水室温浸泡24 h。过滤，残渣再用水重复操作1次。合并水提液，50℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥获得水提物。
2.2 干酪素法［8］
2.2.1 标准曲线的绘制精确称取鞣酸（真空干燥至恒重）43.84 mg置于200 ml容量瓶中，加入30%甲醇水溶液定容，摇匀，得到溶液I。精密吸取溶液I1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别置于 10 ml容量瓶中，分别用30%甲醇补齐至5 ml。然后再加入0.1 mol/L醋酸－醋酸钠缓冲液（pH=5.0）至刻度，摇匀。精密吸取5个不同浓度标准溶液 1 ml分别置于10 ml容量瓶中，加入Folin试剂0.5 ml，再加入2%NaCO3溶液至刻度，混匀。显色后于720 nm处测定吸光度，以蒸馏水作空白对照。 计算 回归方程。
2.2.2 样品鞣质的含量测定精确称取样品145.01 mg于50 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容。精密吸取样品溶液2 ml于25 ml棕色容量瓶中，加入0.1 mol/L醋酸－醋酸钠缓冲液（pH=5.0）10 ml，再加30%甲醇定容，得到溶液II。精密吸取II溶液10 ml置于已盛有干酪素500 mg的50 ml棕色容量瓶中，振荡1 h，过滤，得溶液III。分别吸取II和III溶液1 ml，置于10 ml棕色容量瓶中，各加入Folin试剂0.5 ml，再加2%NaCO3溶液至刻度，摇匀。室温放置12 min后，以蒸馏水作空白对照，在波长720 nm处测定吸光度，为A1和A2。由两吸光度之差（ΔA）代入回归方程，计算活性鞣质的含量。
2.3 络合滴定法［9］
2.3.1 0.05 mol/L EDTA-2Na的标定称取18.6 g EDTA-2Na于1 000 ml锥形瓶中，加蒸馏水1 000 ml溶解，摇匀，备用。 精密称取干燥至恒重的基准氧化锌0.120 g，加入3 ml稀盐酸使溶解，再加水25 ml，滴入1滴0.025%甲基红乙醇溶液 ，再滴加氨试液至溶液显微黄色。加水25 ml，氨－氯化铵缓冲液（pH=10）10 ml，铬黑T指示剂少许。用EDTA－2Na滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，并将滴定结果用空白校正。每毫升EDTA-2Na标准液相当于4.069 mg氧化锌。
2.3.2 样品鞣质的含量测定精密称取旋覆花水提物粉末130mg，用蒸馏水溶解并且稀释至80 ml，摇匀，置于水浴上温热至（35±2）℃。精密吸取1 mol/L醋酸锌液4 ml于100 ml容量瓶中，加饱和氨水2.8 ml，摇匀，使白色沉淀溶解，将前液全量缓缓注入容量瓶中，并不断振摇，加蒸馏水稀释至刻度，继续振摇1min，再置于（35±2）℃水浴中继续温热30 min（间歇振摇数次），取出，冷至室温。摇匀后过滤，弃去初滤液。精密吸取续滤液20 ml，置于500 ml锥形瓶中，加蒸馏水300 ml，氨－氯化铵缓冲液（pH=10）25 ml，铬黑T指示剂少许，摇匀，用EDTA-2Na标准溶液滴定至溶液由紫色变为蓝色，结果用空白校正。按下式 计算 鞣质含量。
鞣质含量（%）＝ 0.156 5×（Vo－Vs）×M×20W×100%
其中 Vo－空白对照消耗的EDTA－2Na体积（ml）；
Vs－样品消耗的EDTA－2Na体积（ml）；
M－EDTA－2Na的浓度（mol/L）；
W－样品重量（g）
3 结果
3.1 干酪素法测定的鞣质含量干酪素法测得鞣酸标准曲线的回归方程：A=55.892C+0.013 7，r=0.998 8。鞣酸在0.00 ～10.96 μg/ml浓度范围内线性关系良好。旋覆花水提物平行取3份样品，用该法测得鞣质含量分别为：5.88%，6.04%，5.96%，平均含量为5.96%，RSD=1.68%。
3.2 络合滴定法测定的鞣质含量取基准氧化锌标定液3份，用EDTA-2Na标准液滴定至溶液由紫色变为蓝色。消耗EDTA-2Na标准液体积分别为29.55，29.53，29.48 ml，计算得到EDTA-2Na滴定液浓度为0.049 95 mol/L（n=3，RSD=1.22%）。同时旋覆花水提物平行测定3份样品，其中鞣质含量分别为8.42%，8.2%，8.40%，平均含量为8.32%（n=3，RSD=2.09%）。
4 讨论
鞣质具有较强极性和不稳定性，遇酸碱和高温不稳定。另外高温也可能使多糖类成分发生改变，因此本实验旋覆花水提物的制备是在室温条件下进行。先用95%乙醇提取色素和极性较弱的成分，然后再用水提取获得水提物，这样可以使鞣质类和糖类的提取率和稳定性提高。
鞣质的生理活性除收敛作用之外，近年来 研究 发现其还具有其它的药理作用，如：①抗菌和抗病毒；②抑制肝脏线粒体和微粒体的脂质过氧化；③抗诱变；④降低血中尿素氮浓度；⑤抑制纤维蛋白溶酶活性；⑥抗肿瘤和抗癌变作用［10］。国外报道绿茶中鞣质含量约13%左右，其中茶多酚100 mg/kg给予四氧嘧啶糖尿病大鼠，能显著降低糖尿病大鼠血糖，提高血浆中超氧化歧化酶和谷胱甘肽水平［11］。本实验旋覆花水提物中鞣质含量约8%，其是否是降血糖和降血脂的有效成分尚待进一步分离和活性评价。
【 参考 文献 】
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［2］郭启雷，杨峻山. 旋覆花属植物中半萜类成分及药理活性研究进展［J］.天然产物研究与 发展 ，2005，17（6）：804.
［3］吴一兵，王云志，查建蓬，等. 欧亚旋覆花中三萜和甾体化合物的分离和结构鉴定［J］.中草药，2006，37（5）：666.
［4］查建蓬，付 焱，吴一兵，等. 欧亚旋覆花挥发油的GC－MS 分析 ［J］.中药材，2005，38（6）：466.
［5］Shan Jun-jie, Yang Ming, Ren Jin-wei. Anti-diabetic and hypolipidemic effects of aqueous-extract from the flower of Inula japonica in alloxan-induced diabetic mice［J］.Biol. Pharm. Bull, 2006, 29 (3)：455.
［6］罗文毓，李计萍，章育中. 中药中鞣质含量测定 方法 的比较研究［J］. 药物分析杂志，1990，10（4）：249.
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［8］杨 铮，秦丽娟，高建萍，等. 干酪素法测定诃子中鞣质的含量［J］.内蒙古中医药，2005，24（6）：31.
［9］贾天柱，刁秀兰，李军，等. 狗脊不同炮制品中鞣质的含量测定［J］.中成药，2002，24（1）：32.
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［11］Sabu M C, Smitha K, Ramadasam K, et al. Anti-diabetic activity of green tea polyphenols and their role in reduceing oxidative stress in experimental diabetes［J］.J Ethnopharmacology, 2003, 83(1-2)：109.